产品中心

一、产品信息（Product information）
产品编号：XG-K3008
规格：96T
检测范围：78.125-5000 pg/ml
敏感度：20pg/ml
重复性：板内、板间变异系数均＜5%
用途：用于体外定量分析人组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清、血清、血浆、和其他体液中天然和重组的B7-H4的浓度。

二、产品描述（Description）
B7-H4又称B7x和B7S1，是一种在活化淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、上皮细胞和骨髓间充质干细胞表面表达的免疫共刺激蛋白。它与活化T细胞的结合抑制T细胞的反应，诱导T细胞周期阻滞。反向信号可诱导B7-H4表达细胞周期阻滞或凋亡。B7-H4在几种肿瘤中表达上调，与肿瘤的进展和转移有关.一种可溶性的B7-H4作为诱饵分子，在卵巢癌、肾癌和类风湿关节炎患者的血清中升高。本试剂盒为预包被板，用于科研，而非诊断。

三、试剂盒组成（Materials Provided）

试剂	规格	数量	存储条件	有效期
Precoated ELISA plate	8×12	1块	2-8℃	2-8℃，12个月
Standard	10ng/管	2管	2-8℃	2-8℃，12个月
Antibody-Bio	10μl/管	1管	-20℃	-20℃，12个月
Avidin-HRP	5μl/管	1管	-20℃	-20℃，12个月
Dilution buffer	0.3g /瓶	2瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
Washing buffer(20×)	30ml/瓶	2瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
TMB	11ml/瓶	1瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
Stop solution	6ml/瓶	1瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
封板膜		2张	室温
说明书		1份	室温

注意：使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致

四、需要实验者自行准备的试剂与仪器（Materials to be Provided by the End-User）
1．酶标仪（波长450nm，建议参考仪器使用说明提前预热）。
2．系列可调节移液器及吸头，一次性检测样品较多时，最好用多通道移液器。
3. 蒸馏水或去离子水。
4. 干净的试管和 Eppendorf 管。
5. 全新滤纸。
6. 漩涡振荡器和磁力搅拌器。
7. 自动洗板机。
8. 37℃恒温箱。

五、样品的准备和保存（Specimen Collection and Handling）
1. 细胞培养上清：100×g离心5min，立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
2. 细胞裂解液：对于贴壁细胞，去除培养液，用 PBS或无血清培养液洗一遍，去除液体后，加入适量（1-1.5ml）裂解液，用移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。对于悬浮细胞，100×g离心5min收集细胞，用 PBS或无血清培养液洗一遍，去除液体后，加入适量（1-1.5ml）裂解液，用移液器吹打数下打把细胞吹散，充分裂解后，10000-14000g 离心3-5min，取上清，立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
3. 血清：采用促凝管收集血液，室温凝固至少30 min，1000×g离心10 min，收集血清。立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
4. 血浆：采用抗凝管抽血后 30 min内离心 1000×g 10 min。立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
5. 其他体液：脑脊液、关节腔滑膜积液、尿液、精液等按上述要求，用无菌管收集，根据样本不同特性（酶解等）去除杂质，1000×g离心10-20 min，获得澄清液体。立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。

六、试剂和样品的准备（Reagent and Sample Preparation）
1. Dilution buffer工作液的准备：每瓶用30ml，1×PBS稀释。
2.Washing buffer工作液的准备：根据实际使用量计算总量，用纯水20倍稀释。（例如：取1ml的Washing buffer（20×），19ml 的纯水，混合均匀）
3.人B7-H4标准品的稀释和使用：在使用前2h内准备。试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
（1）配制 10000pg/ml 标准品：取1000μl Dilution buffer加入标准品管内，盖好后反复颠倒/震荡以助溶解，静置 10 min以上。
（2）配制5000pg/ml→78.125pg/ml 标准品：准备 8只 Eppendorf 管，每管加 500μl Dilution buffer，分别标记上 5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312pg/ml，156.25pg/ml，78.125pg/ml，0pg/ml，取500μl 10000pg/ml 的标准品加入标记 5000pg/ml 的管中，混匀后同样取出500μl 加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管（如下图所示）。
注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在 12 h内使用。
4.Antibody-Bio 抗体工作液的准备：根据每孔需要 100μl 计算总的用量。1:4000用Dilution buffer 稀释，轻轻混匀，在使用前 2 h内准备。（例如：取1μl的Antibody-Bio，4000μl的Dilution buffer，混合均匀）
5.Avidin-HRP工作液的准备：根据每孔需要 100μl 计算总的用量。1:6000用Dilution buffer 稀释，轻轻混匀 ，在使用前 1 h内准备。（例如：取1μl的Avidin-HRP，6000μl的Dilution buffer，混合均匀）
6.研究者须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA 试剂盒的最佳检测范围，样本用Dilution buffer稀释。本试剂盒血清和血浆样本建议直接加样，未知样本需进行梯度稀释以确定最佳稀释倍数。

七、操作过程（Assay Procedure）
1. 使用前，将所有的试剂充分混匀，避免产生气泡。
2. 根据实验孔（标准品、样品和空白孔）数量，确定所需的板条数目。
3. 加样：每孔中加入100μl标准品（5000pg/ml-0pg/ml，每个浓度按序加）或者样品，37℃孵育2h。
4. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 300μl/孔，洗板3遍，弃去孔内液体，在滤纸/吸水纸上拍干。
5. 加检测抗体：加入稀释好的Antibody-Bio 100μl/孔，盖上封板膜，37℃孵育1h。
6. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 300μl/孔，洗板3遍，弃去孔内液体，在滤纸/吸水纸上拍干。
7. 加酶：加入Avidin-HRP工作液100μl/孔，盖上封板膜，37℃孵育1h。
8. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 300μl/孔， 洗板6遍，弃去孔内液体，在滤纸/吸水纸上拍干。
9. 显色：加入TMB，100μl/孔，37℃避光孵育15min左右。
10. 终止反应：加入Stop solution 50μl/孔。
11. 读板：终止后10min内，用检测波长450nm读值。

八、结果分析（Typical Data）
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种软件来计算。若样品的OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。每次检测均需要做标准曲线
注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘制标准曲线来计算标品含量

九、注意事项（Notice）
1. 使用前所有的试剂平衡至室温，对于比较珍贵的样本，建议做复孔，取平均值。
2. 试剂应按管上的标签说明书储存。
3. 预包被板条使用前，请恢复到室温后再打开外包装袋，实验室中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，4℃可保存1个月。其余不用试剂应包装好或盖好。
4. Washing buffer（20×）在4℃保存可能有结晶析出，使用前务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混匀等）在配置成Washing buffer（1×）工作液。
5. 检测抗体体积很小，使用前请高速短暂离心管子，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。
6. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉感染。
7. 使用前检查试剂盒内各种试剂：试剂稀释、加样和中止反应充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要，最好使用低速频率振荡器或者反应过程中每15min手工摇匀一次。
8. 实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。
9. 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。
10. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
11. TMB对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免金属接触影响结果。有毒，避免用手接触！准备使用的TMB若变为蓝色，表明TMB已经污染，请丢弃。请在终止反应后10min内读取OD值。
12. 请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。冬季室内温度偏低，请使用恒温箱或培养箱孵育为好。
13. 试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。
14. 大于5000pg/ml的sB7-H4样本应以Dilution buffer 稀释后重做。
15. 特异性：不与同一家族里面的其他抗体反应。

十、参考文献 (References)
1.B7-H4单克隆抗体及ELISA试剂盒的研制[P]. 丁思思,刘翠平,吴鸿雅,张学光.2017
2.可溶性B7-H4在早期胃癌中的诊断价值探讨[J]. 华建江,陈望,姜健,杨庆伟,徐志康,梁巧玲.中国免疫学杂志 . 2012 (08)
3.XiaoJian-Ping;WangXue-Rong;ZhangSen;Wang Jun;Zhang Chao;Wang De-Guang，Increased Serum Levels of Soluble B7-H4 in Patients with Systemic Lupus Erythematosus，Iranian journal of immunology : [J].2019.（03）

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