产品中心

一、产品信息（Product information）
产品编号：XG-K3017
规格：96T
检测范围：156.25-10000 pg/ml
敏感度：55pg/ml
重复性：板内、板间变异系数均＜5%
用途：用于体外定量分析人组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清、血清、血浆、和其他体液中天然和重组的BTN3AS的浓度。

二、产品描述（Description）
BTN分子由两个Ig结构域(IGV、IgC 2)、一个跨膜结构域和一个位于细胞质中的大羧基末端结构域B3.2(或PRYSPRY)组成。人BTN3A基因座有BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3三个位点，而目前称为CD 277的BTN3A分子在小鼠基因组中缺失。BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3是Ig超家族B7/丁酪氨酸样受体的成员，调节T细胞的功能，与血液肿瘤，卵巢癌，乳腺癌，胃癌有关。BTN 3受体参与T淋巴细胞的调节，在哺乳动物中具有广泛的可塑性。系统发育分析揭示了BTN3的协同进化过程，其特征是编码信号肽和免疫球蛋白可变区(IGV)的信号肽区和免疫球蛋白可变区(IGV)区域均质化。虽然BTN3A1与B7分子相似，但其作用并不是作为共受体或共刺激分子，而是以类似于MHC限制性肽的方式直接呈现给γδTCR。外周血和体液中存在可溶性BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3，也称之为Pan-BTN3AS。采用ELISA法检测其水平变化，是恶性肿瘤如胰腺癌和胃肠基底细胞癌预后评估有价值的生物标志物。本试剂盒为预包被板，用于科研，而非诊断。


三、试剂盒组成（Materials Provided）

试剂	规格	数量	存储条件	有效期
Precoated ELISA plate	8×12	1块	2-8℃	2-8℃，12个月
Standard	10ng/管	2管	2-8℃	2-8℃，12个月
Antibody-Bio	10μl/管	1管	-20℃	-20℃，12个月
Avidin-HRP	5μl/管	1管	-20℃	-20℃，12个月
Dilution buffer（抗体稀释液）	0.3g /瓶	2瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
Washing buffer(20×)	30ml/瓶	2瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
TMB	11ml/瓶	1瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
Stop solution	6ml/瓶	1瓶	2-8℃	2-8℃，12个月
封板膜		2张	室温
说明书		1份	室温

注意：使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致

四、需要实验者自行准备的试剂与仪器（Materials to be Provided by the End-User）
1．酶标仪（波长450nm，建议参考仪器使用说明提前预热）。
2．系列可调节移液器及及吸头，一次性检测样品较多时，最好用多通道移液器。
3. 蒸馏水或去离子水。
4. 干净的试管和 Eppendorf 管。
5. 全新滤纸。
6. 漩涡振荡器和磁力搅拌器。
7. 自动洗板机。
8. 37℃恒温箱。

五、样品的准备和保存（Specimen Collection and Handling）
1. 细胞培养上清：100×g离心5min，立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
2. 细胞裂解液：对于贴壁细胞，去除培养液，用 PBS或无血清培养液洗一遍，去除液体后，加入适量（1-1.5ml）裂解液，用移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。对于悬浮细胞，100×g离心5min收集细胞，用 PBS或无血清培养液洗一遍，去除液体后，加入适量（1-1.5ml）裂解液，用移液器吹打数下打把细胞吹散，充分裂解后，10000-14000g 离心3-5min，取上清，立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
3. 血清：采用促凝管收集血液，室温凝固至少30 min，1000×g离心10 min，收集血清。立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
4. 血浆：采用抗凝管抽血后 30 min内离心 1000×g 10 min。立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。
5. 其他体液：脑脊液、关节腔滑膜积液、尿液、精液等按上述要求，用无菌管收集，根据样本不同特性（酶解等）去除杂质，1000×g离心10-20 min，获得澄清液体。立即分析或分装后-80℃冷冻保存，避免反复冻融。

六、试剂和样品的准备（Reagent and Sample Preparation）
1. Dilution buffer工作液的准备：每瓶用30ml，1×PBS稀释。
2.Washing buffer工作液的准备：根据实际使用量计算总量，用纯水20倍稀释。（例如：取1ml的Washing buffer（20×），19ml 的纯水，混合均匀）
3.人BTN3AS标准品的稀释和使用：在使用前2h内准备。试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
（1）配制 10000pg/ml 标准品：取1000μl Dilution buffer加入标准品管内，盖好后反复颠倒/震荡以助溶解，静置 10 min以上。
（2）配制 5000pg/ml→156.25pg/ml 标准品：准备 7只 Eppendorf 管，每管加 500μl Dilution buffer，分别标记上5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312.5pg/ml，156.25pg/ml，0pg/ml，取500μl 10000pg/ml 的标准品加入标记 5000pg/ml 的管中，混匀后同样取出500μl 加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管（如下图所示）。
注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在 12 h内使用。
4.Antibody-Bio 抗体工作液的准备：根据每孔需要 100μl 计算总的用量。1:4000用Dilution buffer 稀释，轻轻混匀，在使用前 2 h内准备。（例如：取1μl的Antibody-Bio，4000μl的Dilution buffer，混合均匀）
5.Avidin-HRP工作液的准备：根据每孔需要 100μl 计算总的用量。1:6000用Dilution buffer 稀释，轻轻混匀 ，在使用前 1 h内准备。（例如：取1μl的Avidin-HRP，6000μl的Dilution buffer，混合均匀）
6.研究者须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA 试剂盒的最佳检测范围，样本用Dilution buffer稀释。本试剂盒血清和血浆样本建议原液加，未知样本需进行梯度稀释以确定最佳稀释倍数。

七、操作过程（Assay Procedure）
1. 使用前，将所有的试剂充分混匀，避免产生气泡。
2. 根据实验孔（标准品、样品和空白孔）数量，确定所需的板条数目。
3. 加样：每孔中加入100μl标准品（10000pg/ml-0pg/ml，每个浓度按序加）或者样品，37℃孵育2h。
4. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 300μl/孔，洗板3遍，弃去孔内液体，在滤纸/吸水纸上拍干。
5. 加检测抗体：加入稀释好的Antibody-Bio 100μl/孔，盖上封板膜，37℃孵育1h。
6. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 300μl/孔，洗板3遍，弃去孔内液体，在滤纸/吸水纸上拍干。
7.加酶：加入Avidin-HRP工作液100μl/孔，盖上封板膜，37℃孵育1h。
8.洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 300μl/孔， 洗板6遍，弃去孔内液体，在滤纸/吸水纸上拍干。
9. 显色：加入TMB，100μl/孔，室温避光孵育15min左右。
10. 终止反应：加入Stop solution 50μl/孔。
11. 读板：终止后10min内，用检测波长450nm读值。

八、结果分析（Typical Data）
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种软件来计算。若样品的OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。每次检测均需要做标准曲线
注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘制标准曲线来计算标品含量

九、注意事项（Notice）
1. 使用前所有的试剂平衡至室温，对于比较珍贵的样本，建议做复孔，取平均值。
2. 试剂应按管上的标签说明书储存。
3．预包被板条使用前，请恢复到室温后再打开外包装袋，实验室中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，4℃可保存1个月。其余不用试剂应包装好或盖好。
4. Washing buffer（20×）在4℃保存可能有结晶析出，使用前务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混匀等）在配置成Washing buffer（1×）工作液。
5. 检测抗体体积很小，使用前请高速短暂离心管子，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。
6. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉感染。
7. 使用前检查试剂盒内各种试剂：试剂稀释、加样和中止反应充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要，最好使用低速频率振荡器或者反应过程中每15min手工摇匀一次。
8. 实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。
9. 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。
10. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
11. TMB对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免金属接触影响结果。有毒，避免用手接触！准备使用的TMB若变为蓝色，表明TMB已经污染，请丢弃。请在终止反应后10min内读取OD值。
12. 请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。冬季室内温度偏低，请使用恒温箱或培养箱孵育为好。
13. 试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。
14. 大于10000pg/ml的sBTN3AS样本应以Dilution buffer 稀释后重做。
15. 特异性：不与同一家族里面的其他抗体反应。

十、参考文献 (References)
1. Fanale D, Incorvaia L, Badalamenti G, De Luca I, Algeri L, Bonasera A, Corsini LR, Brando C, Russo A, Iovanna JL, Bazan V. Prognostic Role of Plasma PD-1, PD-L1, pan-BTN3As and BTN3A1 in Patients Affected by Metastatic Gastrointestinal Stromal Tumors: Can Immune Checkpoints Act as a Sentinel for Short-Term Survival? Cancers (Basel). 2021 Apr 27;13(9):2118. 
2. Bian B, Fanale D, Dusetti N, Roque J, Pastor S, Chretien AS, Incorvaia L, Russo A, Olive D, Iovanna J. Prognostic significance of circulating PD-1, PD-L1, pan-BTN3As, BTN3A1 and BTLA in patients with pancreatic adenocarcinoma.
Oncoimmunology. 2019 Feb 3;8(4):e1561120. 
3. 嗜乳脂蛋白第三亚家族成员一基因的研究现状及进展；张佳玉，李文倩，张东伟，哈尔滨医科大学附属第二医院普外八科，150086，中华实验外科杂志，2020.02第37卷第2期，DIO,10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2020.02.052.

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