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新一代亲和纯化配基-nanobody

来源:旭光科星    浏览量:1317    发布日期:2017-06-23      关键词:旭光科星  
上一期与大家分享了纳米抗体的结构特征,我们知道结构特征决定了性质,性质又决定了其应用。在此顺便总结一下纳米抗体的性质:
分子量小纳米抗体是目前已知最小的功能性抗原结合片段,其分子量仅为15kD;其晶体直径仅为2.5nm,长4nm,因此组织穿透力强,甚至可以穿过血脑屏障,作为成像分子时在体内成像能够快速到达靶点,并迅速被肾脏代谢。
制备周期短传统的通过细胞融合制备单克隆抗体周期长约6个月,而通过噬菌体展示技术能够绕开细胞的融合,更加快速的制备单克隆单体;其次通过天然文库可直接筛选得到binder。
高稳定性纳米抗体比传统抗体具有更高的稳定性,能耐受更加恶劣的条件,研究证实,将VHH抗体在37℃放置一周或在高温条件(90 ℃)下保存,它都能保持比较好的生物活性,因此纳米抗体比传统抗体更易储藏和运输,有些纳米抗体甚至可以通过消化道继续存活。
免疫原性弱VHH抗体与人抗体的重链可变区具有超过80%的序列同源性,并且二者的3D结构可以重合,因此人源化简单。另外,VHH的稳定性高而不容易聚集,从而避免了由蛋白质聚集导致的免疫原性增强的问题。
高抗原结合性纳米抗体能到达传统抗体无法达到的表位,由于其长的CDR3区,能够伸入到酶的活性中性,细菌或病毒表面受体的裂缝中,甚至可以有效的穿过血脑屏障,这使得纳米抗体有望成为治疗老年痴呆症的新药。
易表达,易纯化 由于scFv中的VL和VH经常发生错配,导致scFv多以包涵体形式表达。而VHH仅由单个结构域组成,不存在结构域错配的问题;而且VHH的溶解性较好,因此很容易实现在大肠杆菌中的可溶性表达。
易于构建构建多价和多功能抗体普通抗体分子太大,不适于构建多价或多功能抗体;利用scFv抗体构建多价或多功能抗体时,常因为VH和VL结构域错配而导致聚集或亲和力下降,并且表达水平低且易被降解。VHH具有严格的单结构域特性、高水溶性和高稳定性等优点,十分适合构建多价或多功能抗体;
最近几年纳米抗体在国内外非常火热,相信很多小伙伴都在从事纳米抗体制药,分子体内非侵入式分子成像,体外诊断等相关研究。我将给大家分享纳米抗体的又一应用---新一代纯化配基。亲和纯化亲和层析(Affinity Chromatography,AC)是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化,如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等;也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。可以说亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一,也是最方便简单的方法。
纳米抗体作为亲和配基有哪些优势呢?
1.高特异性
理论上纳米抗体能够识别几乎所有靶标,因此可以制备针对每种蛋白的配基,纯化没有亲和标签的重组蛋白或者天然蛋白来说,这将大大降低纯化难度和成本,提高纯化得率。虽然传统抗体也能作为纯化配基,但是纯化时轻链易脱落导致二次污染。其次能用来纯化不同亚型的蛋白,如利用纳米抗体制备分识别乙肝表面抗原ad与ay的纳米抗体,来分离纯化ad与ay;纯化HCG的α链与β链。
2.高亲和力
纳米抗体虽然是单域抗体,但是其亲和力与Fab,ScFV相比,没有差别,亲和力可达到nM~pM级。
3.结构稳定
因纳米抗体除了常见的FR1与FR3之间的二硫键外,CDR1或FR2与CDR3还有一对二硫键,因此其结构比较稳定,能够容忍高离子强度,有机溶剂,低pH值和高温。如有些抗原是脂溶性化合物,在纯化这类抗原时就需要配基能够容忍一定的有机溶剂,如利用纳米抗体制备黄曲霉毒素B1(AFB1),赭曲霉毒素(OTA)免疫亲和柱等。
4.多种结构形式
纳米抗体是通过基因工程的方法筛选得到的,因此可以知道其蛋白序列,这方便了抗体的改造,可以将抗体改造为双价,三价等,同时也能与多种融合蛋白一起融合表达,来达到实验的目的。
5.高载量
纳米抗体分子量小,能够在介质表面修饰时达到很高的比表面,提高了其载量。
新一代亲和纯化配基的筛选
纳米抗体主要来源于驼源和软骨鱼,通过免疫构建文库或者直接从天然文库中筛选binder的技术已经非常成熟了,在此就不在鳌述了。一些对pH值敏感的蛋白来说,筛选过程就显得特别重要了,如何控制筛选流程来获得能在温和条件下洗脱蛋白的binder,就需要研究者去探究了。其次还要去平衡亲和力与洗脱条件的关系。
应用举例
1.抗体的纯化
商品化的抗体多采用protein A来纯化,但是protein A却有很强的情况依赖,如不能用来纯化IgG3;原料中的蛋白酶降解,导致protein A 脱落,引发免疫原性,引发抗体聚集;不能够容忍高盐离子强度等。Bio Affinity Company (Naarden, The Netherlands)利用纳米抗体开发了一系列亲和纯化填料- CaptureSelect™ ligands,与protein A 相比,该配基能在碱性条件下非常稳定且洗脱条件温和,根据抗体结构开发了一系列针对抗体恒定区的亲和纯化填料如CH1,CL,Fc,用来纯化不同条件下的抗体,如利用针对CH1 or CL区域的纳米抗体纯化Fab。该公司已经被ThermoFisher收购。

3.腺相关病毒纯化
在AVV产品中,残留的宿主细胞蛋白,牛血清蛋白,核酸酶或者核酸等杂质,不但会影响转染效果而且会引起免疫反应,为了得到较高纯度产品,经常需要将超速离心法,液相色谱法,化学试剂发和超滤发联合应用。但是这些方法往往步骤繁琐,成本高,得率低。POROS™ CaptureSelect™ AAV8 andAAV9 Resins 是基于纳米抗体的纯化介质,用来一步纯化获得高纯度的AAV8与AAV9。理论上可以针对AVV1,2,4,5,8,9等不同血清型载体,制备亲和纯化载体。
4.科研用Nano-traps
Nano-traps是德国chromotek公司推出的以驼源VHH为配基的亲和纯化介质,VHH 娇小 的个体 (直径 2.5 nm×高度 4 nm),使其能够以高密度牢固地结合于固相载体捕捉微量抗原,是传统抗体所不能比拟的。通过将VHH偶联到magic beads 与 agarose beads上,One step一步法完成IP /Co-IP |/ChIP,让您的免疫沉淀更简易,更便捷,更可靠,更专业,无传统抗体的轻链和重链干扰。该产品具有:
√极端稳定
√70℃仍保持稳定,functionalin 2M NaCl or 0.5% SDS
√解离常数范围在nM内
√高特异性
√缩短孵化时间(只需5-30min)
√从细胞提取物或细胞器中定量分离融合蛋白及结合因子
√超低的非特异性结合影响
√无污染的普通抗体的轻链与重链
小结
最后我想说我不是来给他们打广告的,这给我们国内做纯化填料的公司指明了又一条道路,我们公司也奋斗在这条路上。不得不说目前国内进口羊驼还比较贵,开发周期长和成本相对较高。希望我们能够沉下心来,做出好的产品,为我们的生物行业舔砖加瓦。

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